絲組二肽對牛血清白蛋白的切割作用研究

    高等學?；瘜W學報所究筒報絲組肽對牛血清白蛋白的切割作用研究陳晶萬榮劉海蔣宇揚趙玉芬清華大學生命科學與工程研，院，化學系生命有機磷化學教育部重點實驗室，北京100084肽與蛋白質的切割作為生物化學中的熱點之，具有非常廣泛的應用。長期以來，天然存在的多種蛋白酶如胰蛋白酶171糜蛋白酶1付1油子其割的主要工具。但是這些酶只能在某些特定的條件如，值和溫度等下使用，而且由于蛋白酶對底物的特異性要求，因而切割蛋白的斷裂位點相對較少，有定的局限性而現代生物化學及分子生物學的發(fā)展在蛋白切割方面提出了越來越多的要求12，如蛋白部分合成，大蛋白的序列測定，蛋白區(qū)域結構與功能的分析，蛋白與其它蛋白核酸膜形成復合物的研究3和蛋白折疊及疾病治療等等，這些都要求研究新的蛋白切割方法。在這種情況下，化學切割試劑的研宄與發(fā)展越來越受到重視。在己有的化學切割試劑中，邪1.由于活性較高，專性地在的碳端切斷，副產物較少而得到了較普遍的應用；但是這種試劑毒性較大，反應條件苛刻4.各種過渡金屬離子如和，郵1與有機物形成的，物作為1刀，試劑也是研，的熱點17，但妃這種試劑的斷毅機即。絕大多數是自由基機理，會導致蛋，結構破壞。因此進，研新的化學切割試劑幾有很遂要的意義。

　　
    眾所周知，絲氨酸蛋白酶的活性位點是絲氨酸5，辦組氨酸8及天冬氨酸人叩，其中361與此更是不可缺少的1.我們12在以前的工作經發(fā)現絲組肽1以水解某嗚1和民產生連續(xù)的切割譜帶。本文中則以絲組肽為模型，模擬天然蛋白酶，研究該肽對蛋白質的切割作用。實驗證明，在定的1值范圍內，該肽對牛血清白蛋白具有較明顯的切割作用。這是種新型1實驗部分1.1試劑與材料絲組肽567他1版及組絲肽1購自14物制劑公司美國，絲肽31.，內組肽購自咕以公司，牛血沾白蛋白3，1；奶，8為7分裝，絲氨酸辦組氨酸汕1購自打尜，乙醇胺乙醇胺乙安及異丙醇胺均為分析純，絲氨酸甲酯3，6168161由絲氨酸甲酯化得到。實驗用水均為去離子水，所有溶液及容器均經過高溫高壓滅菌。

　　
    1.2檢測手段切割試劑與83人濃度分別為2.5，1化及181化，在50，與60水浴中保溫定時間6，1質試分數12的3此變性聚丙烯酰胺膠分離，快速銀染法染色。

　　
    2結果與討論21值與溫度對切割的影響使用如，出他1曬8均緩沖液磷酸鹽乙酸鹽硼酸鹽各40麗為緩沖體系，研宄了，植從4.09.他寬范圍內的1刃割怙況，發(fā)現作5保溫反應5后，1出值為60與7.0時，加36樣品使原料帶明顯消失，而相應的空白實驗沒有明顯變化，6.的缺徒，在，1=4，原料發(fā)生水解，產生條水解帶。在6似1反應50基金項目國家自然科學重點項目基金批準號232004和訪問學者基金批準號教技司1999153號資助。

　　
    聯系人簡介趙玉斧1948年出生。，女，博士，教授，博士生導師，中國科學院院士，主要從事生命有機化學研后，你5.認6.0的原料帶都徹底消失，而1=7.的原料帶還有殘余惘1.由此可知，5.也在近中性，條件下1=5.07.0對蛋白質的切割活性**。

　　
    22緩沖液種類對切割的影響8只緩沖液檸檬酸，檬酸鈉緩沖體系磷酸氫鈉磷酸氫鈉緩沖體系心他緩沖體系不加緩沖液對比所有緩沖液均為=6.0，6廠反應24，實驗明，8辟愛沖液及磷酸鹽緩沖液對切割有明顯的促進作用，而檸檬酸鹽緩沖液與玨81緩沖液則抑制反應進行；不加緩沖液3，158自身具有定的緩沖能力，在反應前后1值基本保持在6 0左右時可看到加361后83人原料帶變弱，但相對8，爰沖液與磷酸鹽緩沖液變化不明顯2.

　　
    23反應基團作用的研究為研宄。1各官能1在切削1心時所可能起到的作用，分別用結構上與3枕心相似的組絲肽他3絲丙肽361入丙組肽58絲氨酸組氨酸絲氨酸甲酯乙醇胺其相似性3乙醇胺及乙醇胺為對照，研究它們對路人的切割作用濃度與以上反應相1無切割活性，而1為7.0時，36人13具有微弱的切割活性4，這說明361殘基側鏈的羥基是1具有切割活性的必須官能團，而出殘基則增強了切割活性。23，與1在反應100后對83人沒有明顯作用4，說明3，他即使在反應中水解產生361.與其切割活性也不是由這兩種物質弓引的。3絲氨酸絲氨酸甲釀乙醇胺乙醇胺及乙醇胺對85人無切割活性5，考慮到5無切割活性5則證明切割試劑分子中各個官能團之間的空間位置對切割作用也有很重要的影響。

　　
    割活性的必需基團，而肽的酰銨鍵與羧基同組氨酸殘基上的咪唑環(huán)起在定程度上，強了切割活性。反應的最適1值接近中性5.7.0.所有的實驗均現出很好的重現性，而且以細胞色索溶菌酶為切割底物得到了類似的結果。在自然界廣泛存在的各種絲氨酸蛋白水解酶的活性中心都是絲氨酸組氨酸及天冬氨酸而且前兩種氨基酸是缺+可的如果人為地將這兩種物質在空間上靠攏之后，仍具有定的活性，由此可以想象若地球上不存在具有高的活性與選擇性的功能性高分子時，些化學上具有定特殊性的物質如；8將起重要作用。然后在地球的進化過程中，這些物質通過在結構上不斷完善使自身的功能得到顯著提高，最終發(fā)展成為現在的生命狀態(tài)。在這里也可以看到，3，版切割83人的活性很低，而且其機理仍不很清楚，從反應基團作用的研究以及己有的對絲氨酸蛋白酶水解機理的了解，可以認為是36通過咪唑環(huán)與蛋白的負電性基團如羰基及竣基弱的切割活性，然后絲氨酸殘基上的羥基進攻酰胺鍵，使蛋白質斷裂。但這假設是否成立，還需要更多的實驗數據予以證明。

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